Ubikitinaation ja ADP-ribosylaation yhtyminen proteiinissa - E3 ubikitiiniligaasi DTX3L:n biokemian ja rakenteen tutkimus

Proteiinit muodostavat tukirakenteita soluille, lähettävät signaaleja sekä kiihdyttävät biokemialisia reaktioita. Protetiinit säätelevät omaa määräänsä ubikitiini-proteasomijärjestelmän kautta tai säätelemällä geenin ilmentymää. Ubikitiinin rooli proteasomaalisessa proteiinien hajotuksessa sai alulle myös ubikitinaation yksityiskohtaisemman tutkimuksen. Ubikitinaatio on translaation jälkeinen muokkaus, joka ilmenee kovalenttisena sidoksena proteiinin ja ubikitiinin välillä.
Ubikitinaatio muokkaa proteiineja myös siten, että proteiinia ei hajoteta. Ubikitinaatioon tarvitaan kolmenlaisia entsyymejä, jotka jaetaan toimintansa perusteella kolmeen luokkaan: E1, E2 ja E3. Koska E3-entsyymit antavat substraattispesifisyyden, suurin osa ubikitinaatiotutkimuksesta keskittyy mekanismiin, jolla nämä entsyymit toimivat. E3-entsyymien säätelyhäiriöt on yhdistetty syöpään, Parkinsonin ja Alzheimerin tauteihin. Tämän takia näiden entsyymien inhibiittoreita pyritään löytämään.
Tämä opinnäytetyö keskittyy DTX3L-proteiiniin, RING-tyyppiseen ubikitiini E3 -ligaasiin. DTX3L:n merkitys solutasolla on vielä tuntematon, mutta aiemmat tutkimukset yhdistävät sen muun muassa immuunivasteeseen, DNA-vaurioiden korjaamiseen ja androgeenireseptorin signalointiin. Erityisesti DNA:n korjauksen ja androgeenireseptorin osalta prosessi on riippuvainen ADP-ribosyloitujen proteiinien sitomisesta, mikä on mahdollista DTX3L:n kanssa vuorovaikuttavan PARP9:n ansiosta. PARP9:ssä on kaksi makrodomeenia, jotka vuorovaikuttavat ADP-riboosin kanssa. DTX3L-PARP9-kompleksi mahdollisesti myös ADP-ribosyloi ubikitiinia.
Tutkimuksemme tuloksiin sisältyy DTX3L-PARP9-kompleksin sitoutumisaffiniteetin määrittäminen ja vuorovaikutuksesta vastuussa olevien proteiinin osien välillä. Ehdotamme, että PARP9 säätelee DTX3L:n toimintoja. Määritimme D2-domeenin kiderakenteen, joka on DTX3L-oligomerisaation pääasiallinen välittäjä. Rakenne osoitti, että D2 rakenteellinen yksikkö on tetrameeri. Arvioimme myös D2:n evolutionaarisen konservoitumisen ja DTX3L-oligomeerien merkityksen. Tuloksemme osoittavat, että tetrameeri on biologisesti toimiva yksikkö, jota tarvitaan ADP-ribosyloidun androgeenireseptorin tunnistamiseen. Lopuksi, kun otetaan huomioon yhteys DTX3L:n yli-ilmentymisen ja syövän välillä, kehitimme FRET-pohjaisen menetelmän, joka auttaa tutkimaan ligaasin aktiivisuutta reaaliaikaisesti. Menetelmä sopii myös laajojen yhdistekirjastojen seulomiseen, joka johtikin ensimmäisten DTX3L-inhibiittorien löytämiseen.