ADP-ribosyylitransferaasi PARP2:n aktivaatio, vuorovaikutukset ja inhibointi DNA-vaurioiden korjauksessa

ADP-ribosylaatio on translaation jälkeinen modifikaatio, jolla on kriittinen rooli DNA-vauriovasteessa. Ihmisillä on tunnistettu 22 ADP-ribosyylitransferaasia, joista PARP1, PARP2 ja PARP3 aktivoituvat DNA-vaurion vaikutuksesta. Vastauksena DNA-vaurioon nämä entsyymit katalysoivat ADP-ribosylaatiota siirtämällä ADP-ribosyyliosia kohdeproteiiniin ja itseensä. PARP1/2/3:n katalyyttiset C-terminaaliset domeenit ovat konservoituneita, kun taas niiden Nterminaaliset alueet ovat hyvin erilaisia ja todennäköisesti edistävät DNAvaurion tunnistamista ja välittävät entsyymien aktivaatiota. Tässä väitöskirjassa tutkimme PARP2:n N-terminuksen roolia sen automodifikaatiossa ja vapautumisessa DNA:sta. Tunnistimme automodifikaatioon osallistuvat keskeiset seriinitähteet geelipohjaisella PARylaatiomäärityksellä ja tutkimme niiden vaikutusta PARP2:n vapautumiseen DNA:sta fluoresenssipolarisaatiomäärityksellä. Tuloksemme osoittavat, että HPF1:n läsnä ollessa PARP2:n N-terminaaliset Ser8 ja Ser73 ovat ADP-ribosylaation ensisijaisia kohtia, ja Ser8 on tärkein automodifikaatiokohta. Nämä havainnot korostavat PARP2:n N-terminaalin mekanistista merkitystä ADP-ribosylaatiosta riippuvassa vapautumisessa DNA:sta. ADP-ribosylaatiolla on tärkeä rooli DNAvaurioissa, ja seriini ADP-ribosylaatio edistää kromatiinimallintajien rekrytointia DNA:n korjauksen helpottamiseksi. Seriini-ADP-ribosylaatio on seurausta PARP1/2:n ja HPF1:n välisestä vuorovaikutuksesta ja PARP1/2-HPF1-vuorovaikutuksen estäminen on mahdollinen strategia seriini-ADP-ribosylaation moduloimiseksi. Tätä varten kehitimme FRET-pohjaisen suuren läpimenon määrityksen yhdistekirjastojen seulomiseksi PARP-HPF1-vuorovaikutuksen estäjien varalta. Tämän määrityksen avulla tunnistimme alkaaniinin ja dimetyyliakrylsikoniinin yhdisteiksi, jotka häiritsevät PARP-HPF1-vuorovaikutusta. Merkittävää on, että nämä yhdisteet estivät myös täyspitkien PARP1- ja PARP2-proteiinien ADP-ribosylaatioaktiivisuutta häiritsemällä PARPHPF1-kompleksin muodostumista. Kaiken kaikkiaan tämä väitöskirjatyö tarjoaa tietoa PARP2:n N-terminaalisen osan osallistumisesta sen aktiivisuuteen ja esittelee seulonta-alustan PARP–HPF1-vuorovaikutukseen kohdistuvien inhibiittorien löytämiseksi.