Fad5:n (fatty acyl-CoA synthetase) ja ATPaasi Mkl:n rooli Mycobacterium tuberculosis bakteerin lipidien aineenvaihdunnassa ja kuljetuksessa

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) on patogeeni, joka aiheuttaa tuberkuloosia ja on siten johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti. Mtb, jonka soluseinä rakentuu erilaisten lipidien suojaavasta kerroksesta, on sopeutunut selviytymään hengissä hyödyntämällä lipidejä hiilen lähteenään. Mtb:llä on kyky kumota isännän immuunijärjestelmä ja saada aikaan granulooman muodostuminen. Granuloomassa Mtb pystyy selviytymään ja monistumaan käyttämällä niin omia kuin myös isännästä saatuja lipidejä. Mtb:llä on neljä mammalian-cell-entry (mce) –operonia, joista jokainen koodittaa kahta permeaasialayksikköä, YrbEA:ta ja YrbEB:tä sekä kuutta substraattia sitovaa proteiinia, MceA-F. On esitetty, että kaikille neljälle systeemille energian tuottaa ATPaasi Mlk (tunnetaan myös nimellä MceG). ATPaasi Mkl ja permeaasi YrbE1AB:n alayksiköt muodostavat Mce1-kompleksin ABC-transportteriosan, jonka on osoitettu kuljettavan rasvahappoja Mtb:n soluseinän läpi. FadD5:n (putative fatty acyl-CoA synthetase) on ajateltu aktivoivan Mce1-kompleksin sisään kuljettamat rasvahapot jatkokäsiteltäväksi β-oksidaatiossa. Olemme onnistuneesti tuottaneet FadD5:tä E. coli -bakteerissa ja puhdistaneet sen. Biofyysikaalinen karakterisointi osoittaa, että puhdistettu FadD5 on laskostunut ja dimeerinen liuoksessa. Lisäksi FadD5:n ja sen varianttien rakenteet määritettiin röntgensädekristallografialla ja pienkulmaröntgensironnalla, mitkä osoittivat FadD5:n toimivan homodimeerinä ja sen C-terminaalisen domeenin olevan kriittinen entsyymin kokonaisvaltaiselle toiminnalle. Mielenkiintoista on, että FadD5:n C-terminaalinen domeeni leikkautuu pois kiteytymisen aikana. Biokemialliset ja entsyymikineettiset tutkimukset osoittavat, että FadD5 liittää tehokkaasti koentsyymi A:n rasvahappoihin, joiden hiiliketjussa on 12 hiiliatomia tai enemmän. Stabiilin rekombinantti-Mkl-YrbE1AB-kompleksin tuottaminen ja puhdistus olivat haastavia. Kuitenkin tutkimuksessa tuotettiin Mtb:n deleetiokanta, josta poistettiin mkl (mkl) -geeni. Eri lipidejä (kolesteroli ja mykolihappo) ainoana hiilen lähteenään kasvatettujen villityypin ja mkl-kannan vertaileva transkriptioanalyysi suoritettiin käyttämällä RNA-sekvensointia. Nämä tutkimukset ovat antaneet käsityksen transkriptiotason muutoksista ja erityisesti mykolihaposta johtuvista muutoksista, kuten lepotilaan liittyvän fenotyypin ilmaantumisesta ja Mkl:n merkityksestä Mtb:ssä.