Kollageenin prolyyli 4-hydroksylaasit. P4HA3:n rooli kollageenisynteesissä sekä 4Hyp:n rooli kollageenin erityksen säätelyssä

Kollageenit ovat kehon yleisimpiä proteiineja. Kollageenin prolyyli 4-hydroksylaasit (C-P4Ht) ovat tärkeässä asemassa kollageenin muodostumisessa. Ne stabiloivat kollageenin kolmoiskierteisen rakenteen tuottamalla 4-hydroksiproliinia (4Hyp), jota ilman kollageenisäikeet hajoavat fysiologisissa lämpötiloissa. C-P4H entsyymit ovat α2β2 tetrameerejä. Katalyyttisestä α-yksiköstä on olemassa kolme isomuotoa, joita koodaavat P4HA1, P4HA2 ja P4HA3 nimiset geenit, kun taas β-alayksikkönä toimii aina proteiini disulfidi-isomeraasi (PDI). C-P4H hydroksyloi proliinin (-X-Pro-Gly-) jaksoissa 4-hydroksiproliiniksi kollageeneissa ja kollageenisen domeenin omaavissa proteiineissa reaktiossa, joka vaatii rautaa, 2-oksoglutaraattia, askorbaattia ja happea. C-P4H entsyymit ovat potentiaalisia kohteita kollageenin liikatuotantoon liittyvissä taudeissa. P4HA1:n ja P4HA2:n toiminnasta tiedetään paljon, kun taas P4HA3:n tarkka tehtävä on vielä tuntematon.

Selvittääksemme P4HA3:n toimintaa, tutkimme ensiksi sen geeniekspressiota hiiren kehityksen aikana. Tutkimuksemme osoittaa, että P4HA3:n toiminta voisi mahdollisesti olla tärkeää hiiren sikiökaudella sekä syntymän jälkeen aikaisessa kehitysvaiheessa.

Tutkiaksemme P4HA3:n toimintaa solutasolla, tuotimme CRISPR/Cas9-tekniikalla soluja, joista puuttuu P4HA3 sekä soluja, joissa on ainoastaan P4HA3. Tämä väitöskirja tuo esiin uusia tuloksia P4HA3:n toiminnasta, sillä P4HA3:n havaittiin eroavan paljolti P4HA1:sta sekä P4HA2:sta niin geeniekspression kuin mahdollisesti β-alayksikön osalta. Tuloksemme viittaavat vahvasti myös siihen, että P4HA3 ei hydroksyloi kollageenia, ei ainakaan tyypin 1 kollageenia, jolloin sen substraatti on mahdollisesti vielä tunnistamaton ei-kollageeninen proteiini.

Väitöskirjani toisessa osaprojektissa tuotimme soluja, joista on poistettu kaikki C-P4H:t. Kollageenisynteesin tiedetään olevan tarkkaan kontrolloitu prosessi ja alihydroksyloituneen kollageenin on uskottu kertyvän solujen endoplasmiseen kalvostoon (ER), jossa se lopulta hajotetaan, aiheuttaen näin ER stressiä. Yllätykseksemme, tutkimuksemme tulokset osoittavat, että ei-kolmoiskierteiset kollageenipolypeptidit, joista 4Hyp puuttuu täysin, eivät kerry solujen sisään eikä ER stressiä indusoidu, vaan ne eritetään solujen ulkopuolelle ilman ilmeisiä
haitallisia vaikutuksia solujen elinkykyyn. Väitöskirjani tuo tärkeää lisätietoa kollageenisynteesin laatukontrollista ja siitä kuinka solut prosessoivat epänormaalia kollageenia.