Solunulkoisten vesikkelien roolin tutkiminen nefrogeneesin induktiossa joustavan nefrogeneesimallin avulla

Alkiovaiheen hiiren munuaisessa uretersilmu (US) ja metanefrinen mesenkyymi (MM) vuorovaikuttavat kaksisuuntaisesti muodostaakseen nefroneita. Tässä vuorovaikutuksessa on mukana signaalimolekyylejä, kuten Wnt-proteiineja ja kasvutekijöitä, mutta vuorovaikutuksen mekanismit eivät ole täysin selvillä. Tutkimme solunulkoisten vesikkelien (SV) roolia solujen välisen viestinnässä nefrogeneesissä. SV:t osallistuvat solujen väliseen viestintään välittämällä proteiineja ja nukleiinihappoja toimintojen suorittamiseksi organismeissa. SV:ien roolista alkion kehityksessä on kuitenkin erittäin vähän tietoa. Alkiovaiheen (E) 11,5 päivän munuaisen US ja MM ovat rajoitetusti kykeneviä kasvamaan ja munuaisesta saadun primaaristen solujen määrä on vähäinen. Tämä estää SV:ien tutkimisen nefrogeneesin induktiossa. Kehitimme US:ta peräisin olevaan solulinjaan (US-solulinja) perustuvan joustavan nefrogeneesimallin, joka mahdollistaa solujen viljelyn, SV:ien karakterisoinnin, seurannan ja estämisen. Näiden etujen ansiosta mallimme on ylivoimainen in vivo-, ex vivo- ja kantasolumalleja EV-tutkimuksessa. UB-solulinjan aggregaatio E11.5 MM-solujen kanssa tuotti segmentoituneita nefroneja. UB-solulinja ilmentää osaa E11.5 UB:n markkereista. Tutkimuksemme osoitti, että sekä UB että MM erittävät SV:tä nefrogeneesin aikana. UB-solulinjan vesikkelien koko ja markkereiden ilmentyminen (CD63, TSG101, CD9 ja CD81) määritettiin. Proteomiikkatulosten perusteella UB-solulinjan SV:t kuljettavat useita proteiineja, jotka osallistuvat nefrogeneesiin liittyviin signalointireitteihin. Tuloksemme osoittivat, että US-solulinja ilmentää Wnt7b:tä nefronien indusoimiseksi MM-soluissa. Alustavien tietojemme mukaan Wnt7b:tä erittyy sekä SV:ien kuljettamana, että liukoisena muotona supernatantissa. Lisäksi Wnt11 havaittiin US-soluista erittyvissä SV-maisissa hiukkasissa E11.5 munuaisessa. US-solulinjan palmitoyloituja GFP-merkittyjä SV:tä erittyi nefroninmuodostusalueelle nefrogeneesin aikana. US-solulinjan SV:t eivät aikaansaaneet nefronien muodostumista MM-soluissa, mutta edistivät niiden elossapysymistä ja nefrogeneesikykyä. RalA- ja RalB-geenien ilmentymisen hiljentäminen US-solulinjassa shRNA:lla esti SV-eritystä ja heikensi nefrogeneesiä, mutta osittain heikentynyttä nefrogeneesiä voitiin palauttaa SV:ien lisäämisellä. Yhteenvetona tämä tutkimus loi joustavan nefrogeneesin mallin, joka ratkaisi olemassa olevien mallien rajoitteet SV-tutkimuksissa. SV:t havaittiin olevan oleellinen osa nefrogeneesiä.

Avainsanat: nefrogeneesi, uretersilmu, MM, Wnt, solunulkoiset vesikkelit, US-solulinja, RalA, RalB.